Amplite 荧光 ssDNA 定量试剂盒 *针对微孔板酶标仪进行了优化*

简要概述

Amplite 荧光 ssDNA 定量试剂盒以简单准确的方式来检测单链 DNA。该试剂盒包含所有基本试剂，包括 Helixyte Green ssDNA 试剂、稀释缓冲液和预稀释的 DNA 标准品。 Helixyte Green ssDNA 试剂是一种灵敏的荧光核酸探针，用于定量溶液中的寡核苷酸和单链 DNA (ssDNA)。它使科研人员能够量化低至 100 pg/mL 的寡核苷酸或 ssDNA。这种灵敏度超过吸光度方法的 10,000 倍以上。使用该试剂盒，可检测低至 1 ng/mL 的寡核苷酸或 ssDNA。使用该试剂盒对一些 ssDNA 进行了定量，包括具有相似灵敏度的 M13 和 φX174 病毒 DNA 以及变性小牛胸腺 DNA。它们的检测限不受核酸制剂中常见污染物的明显干扰，包括盐类、尿素、乙醇、氯仿、去污剂、蛋白质、ATP、核苷酸和六碱基短寡核苷酸等。然而，双链 DNA (dsDNA) 和 RNA 确实会干扰检测，因为 Helixyte Green ssDNA 试剂会与 dsDNA 和 RNA 结合以产生荧光信号。 Amplite 荧光 ssDNA 定量试剂盒经过优化，可使用荧光酶标仪定量 dsDNA。

适用仪器

产品说明书

实验方案

概述

1.添加 100 µL ssDNA 标准品或测试样品
2.添加 100 µL Helixyte Green ssDNA 工作溶液
3.在室温下孵育 5-10 分钟
4.检测 Ex/Em=490/525 nm 处的荧光强度

注：以下方案是使用 Helixyte Green ssDNA 定量总核酸含量的示例。 打开前让所有成分升温至室温。 目前没有发现关于 Helixyte Green ssDNA 染色剂的致突变性或毒性的数据。 由于该试剂与核酸结合，因此应将其视为潜在的诱变剂并小心处理。 应特别小心处理 DMSO 原液，因为已知 DMSO 可促进有机分子进入组织。

溶液制备

ssDNA 标准溶液
将 10 uL 100 ug/mL ssDNA 标准溶液（组分 C）添加到 190 uL 检测缓冲液（组分 B）中以获得 5 ug/mL 标准溶液，然后进行 1:3 稀释以获得连续稀释的 ssDNA 标准溶液（SS2- SS7）。请使用AAT Bioquest连续稀释计算器以方便数据处理。

Helixyte Green ssDNA 工作溶液

将 100 μL Helixyte Green ssDNA（组分 A）加入 10 mL 检测缓冲液（组分 B）中，制备 Helixyte Green ssDNA 工作溶液。 通过用箔纸覆盖或将其置于黑暗中来保护工作溶液免受光照。
注意：建议在塑料容器而不是玻璃容器中制备工作溶液，因为染料可能会吸附到玻璃表面。为获得最佳效果，该溶液应在稀释后几小时内使用。
注意：10 mL 的工作溶液对于一个 96 孔板就足够了。

操作步骤

表 1. 纯黑色 96 孔板中 ssDNA 标准品和测试样品的布局。 SS= ssDNA 标准品（SS1 – SS7，1667 至 2.3 ng/mL）； BL=空白控制； TS=测试样品

表2.各孔试剂组成

1.根据表 1和表 2 中提供的布局准备 ssDNA 标准 (NS)、空白对照 (BL) 和测试样品 (TS)。对于 384 孔板，每孔使用 25 μL 试剂，而不是 100 μL。
2.将 100 µL Helixyte Green ssDNA 工作溶液加入 ssDNA 标准品、空白对照和测试样品的每个孔中，使测定体积为 200 µL/孔。 对于 384 孔板，将 25 µL 的 Helixyte Green ssDNA 工作溶液添加到每个孔中，以获得 50 µL/孔的总体积。
3.在室温下孵育反应 5 到 10 分钟，避光。
4.使用 Ex/Em = 490/525 nm（Cutoff在 515 nm 处）的荧光酶标仪检测荧光增加。

图示

图 1. ssDNA 剂量反应是在 96 孔黑色孔板中使用 Amplite Fluorimetric ssDNA 定量试剂盒测量的。

参考文献

An OliGreen-responsive fluorescence sensor for sensitive detection of organophosphorus pesticide based on its specific selectivity towards T-Hg2+-T DNA structure.
Authors: Zhou, Xiaoyuan and Wang, Chenchen and Wu, Lina and Wei, Wei and Liu, Songqin
Journal: Spectrochimica acta. Part A, Molecular and biomolecular spectroscopy (2021): 119155

A novel detection of radon based on its decay product inducing conformational changes of an aptamer probe.
Authors: Long, Minzhi and Deng, Han and Tian, Gang and Song, Chunli and Liu, Hongwen and Shen, Yi and Lv, Changyin
Journal: Analytica chimica acta (2016): 202-7

Studies of DNA Aptamer OliGreen and PicoGreen Fluorescence Interactions in Buffer and Serum.
Authors: Bruno, John G and Sivils, Jeffrey C
Journal: Journal of fluorescence (2016): 1479-87

Accumulation of single-stranded DNA in Escherichia coli carrying the colicin plasmid pColE3-CA38.
Authors: Morales, Magali and Attai, Hedieh and Troy, Kimberly and Bermudes, David
Journal: Plasmid (2015): 7-16

Probing the inherent stability of siRNA immobilized on nanoparticle constructs.
Authors: Barnaby, Stacey N and Lee, Andrew and Mirkin, Chad A
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2014): 9739-44

Cost-effective and scalable DNA extraction method from dried blood spots.
Authors: Saavedra-Matiz, Carlos A and Isabelle, Jason T and Biski, Chad K and Duva, Salvatore J and Sweeney, Melissa L and Parker, April L and Young, Allison J and Diantonio, Lisa L and Krein, Lea M and Nichols, Matthew J and Caggana, Michele
Journal: Clinical chemistry (2013): 1045-51

Sensitive fluorescence assay of anthrax protective antigen with two new DNA aptamers and their binding properties.
Authors: Oh, Byul Nim and Lee, Sungeun and Park, Hye-Yeon and Baeg, Jin-Ook and Yoon, Moon-Young and Kim, Jinheung
Journal: The Analyst (2011): 3384-8

Analysis of DNA complexes with small solutes by CE with LIF detection.
Authors: Lee, Kun-Hong and Huang, Ming-Feng and Liu, Chi-Wei and Chang, Huan-Tsung
Journal: Electrophoresis (2010): 1101-7

Enrichment and fluorescence enhancement of adenosine using aptamer-gold nanoparticles, PDGF aptamer, and Oligreen.
Authors: Chen, Shih-Ju and Huang, Chih-Ching and Chang, Huan-Tsung
Journal: Talanta (2010): 493-8

Fluorescently imaged particle counting immunoassay for sensitive detection of DNA modifications.
Authors: Wang, Zhixin and Wang, Xiaoli and Liu, Shengquan and Yin, Junfa and Wang, Hailin
Journal: Analytical chemistry (2010): 9901-8

Portelite 荧光 ssDNA 定量试剂盒 *针对 Cytocite 和 Qubit 荧光计进行了优化*

简要概述

Portelite 荧光 ssDNA 定量试剂盒用于快速检测单链 DNA。该试剂盒包含所有基本试剂，包括 Helixyte Green ssDNA 试剂、稀释缓冲液和预稀释的 DNA 标准品。 Helixyte Green ssDNA 试剂是一种灵敏的荧光核酸探针，用于定量溶液中的寡核苷酸和单链 DNA (ssDNA)。只需使用提供的缓冲液稀释试剂，添加样品（可接受 1–20 μL 的任何体积），然后使用 CytoCite、Qubit® 或其他手持或台式荧光计（Qubit® 是 ThermoFisher 的商标）读取浓度。该检测对于 50 pg/µL 至 200 ng/µL 的初始样品浓度是准确的，提供了 1–200 ng 的测定范围。该试剂检测长寡核苷酸或 ssDNA。核苷酸和六个碱基或更少的短寡核苷酸不会干扰定量分析。检测限不受核酸制剂中常见污染物的明显干扰，包括盐类、尿素、乙醇、氯仿、去污剂、蛋白质、核苷酸和六碱基短寡核苷酸。然而，双链 DNA (dsDNA) 和 RNA 确实会干扰检测，因为 Helixyte Green ssDNA 试剂会与 dsDNA 和 RNA 结合以产生额外的荧光信号。 Portelite 荧光 ssDNA 定量试剂盒针对 CytoCite 和 Qubit® 荧光计进行了优化。

适用仪器

产品说明书

实验方案

概述

1.准备 Helixyte Green ssDNA 工作溶液
2.在每个 0.2 mL PCR 管中加入 190 µL 1X Helixyte Green ssDNA 工作溶液
3.在每个管中加入 10 µL ssDNA 标准品或测试样品
4.在室温下孵育2分钟
5.使用 CytoCite 荧光计或 Qubit 荧光计检测荧光强度

溶液制备

Helixyte Green ssDNA 工作溶液
使用检测缓冲液（组分 B）将 Helixyte Green ssDNA 试剂（组分 A）稀释 200 倍。 例如，要为 5 个样品制备足够的工作溶液，将 5 μL Helixyte Green ssDNA（组分 A）添加到 1 mL 检测缓冲液（组分 B）中。
注意：通过用箔纸覆盖或将其置于黑暗中来保护工作溶液免受光照。建议在塑料容器而不是玻璃容器中制备溶液，因为染料可能会吸附到玻璃表面。 为获得最佳效果，该溶液应在稀释后几小时内使用。

操作步骤 

样品体积的可接受范围是 1~20 μL，这具体取决于核酸样品的估计浓度。
以下实验方案基于 10 µL 样品体积生成，DNA 浓度范围为 20~1000 ng /mL。
1.将 190 µL 1X Helixyte Green ssDNA 工作溶液添加到每个 Cytocite 样品管 (#CCT100) 或等效的 0.2 mL PCR 管中。
注意：使用薄壁、聚丙烯、透明的 0.2 mL PCR 管，例如 AAT Cat#CCT100。
2.在每管中加入 10 µL ssDNA 标准品或测试样品，然后涡旋混合 2~3 秒。
3.在室温下孵育所有管子 2 分钟。
4.将样品插入 CytoCite 或 Qubit 并使用绿色荧光通道检测荧光。

标准校准曲线的制作
1.执行 1:2 连续稀释：将 10 ng/μL ssDNA Standard #2（组分 D）添加到检测缓冲液（组分 B）中，以获得 10、5、2.5、1.25、0.62、0.31、0.15 ng/μL DNA 标准稀释度。
2.在每个管中加入 190 µL Helixyte Green ssDNA 工作溶液。
3.将 10 µL 标准品加入 0.2 mL PCR 管中，然后涡旋混合 2~3 秒。
4.在室温下孵育反应 2 分钟。
5.将样品插入 CytoCite 并使用绿色荧光通道检测荧光强度。

图示

图 1. 使用 Qubit 荧光计（蓝色）或 CytoCite 荧光计（红色）比较 ssDNA 剂量反应。

参考文献

An OliGreen-responsive fluorescence sensor for sensitive detection of organophosphorus pesticide based on its specific selectivity towards T-Hg2+-T DNA structure.
Authors: Zhou, Xiaoyuan and Wang, Chenchen and Wu, Lina and Wei, Wei and Liu, Songqin
Journal: Spectrochimica acta. Part A, Molecular and biomolecular spectroscopy (2021): 119155

A novel detection of radon based on its decay product inducing conformational changes of an aptamer probe.
Authors: Long, Minzhi and Deng, Han and Tian, Gang and Song, Chunli and Liu, Hongwen and Shen, Yi and Lv, Changyin
Journal: Analytica chimica acta (2016): 202-7

Studies of DNA Aptamer OliGreen and PicoGreen Fluorescence Interactions in Buffer and Serum.
Authors: Bruno, John G and Sivils, Jeffrey C
Journal: Journal of fluorescence (2016): 1479-87

Accumulation of single-stranded DNA in Escherichia coli carrying the colicin plasmid pColE3-CA38.
Authors: Morales, Magali and Attai, Hedieh and Troy, Kimberly and Bermudes, David
Journal: Plasmid (2015): 7-16

Probing the inherent stability of siRNA immobilized on nanoparticle constructs.
Authors: Barnaby, Stacey N and Lee, Andrew and Mirkin, Chad A
Journal: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (2014): 9739-44

Cost-effective and scalable DNA extraction method from dried blood spots.
Authors: Saavedra-Matiz, Carlos A and Isabelle, Jason T and Biski, Chad K and Duva, Salvatore J and Sweeney, Melissa L and Parker, April L and Young, Allison J and Diantonio, Lisa L and Krein, Lea M and Nichols, Matthew J and Caggana, Michele
Journal: Clinical chemistry (2013): 1045-51

Sensitive fluorescence assay of anthrax protective antigen with two new DNA aptamers and their binding properties.
Authors: Oh, Byul Nim and Lee, Sungeun and Park, Hye-Yeon and Baeg, Jin-Ook and Yoon, Moon-Young and Kim, Jinheung
Journal: The Analyst (2011): 3384-8

Analysis of DNA complexes with small solutes by CE with LIF detection.
Authors: Lee, Kun-Hong and Huang, Ming-Feng and Liu, Chi-Wei and Chang, Huan-Tsung
Journal: Electrophoresis (2010): 1101-7

Enrichment and fluorescence enhancement of adenosine using aptamer-gold nanoparticles, PDGF aptamer, and Oligreen.
Authors: Chen, Shih-Ju and Huang, Chih-Ching and Chang, Huan-Tsung
Journal: Talanta (2010): 493-8

Fluorescently imaged particle counting immunoassay for sensitive detection of DNA modifications.
Authors: Wang, Zhixin and Wang, Xiaoli and Liu, Shengquan and Yin, Junfa and Wang, Hailin
Journal: Analytical chemistry (2010): 9901-8