样品实验方案

简要概述

1. 用PBS冲洗细胞
2. 加入500 µL细胞质提取缓冲液
3. 离心20秒
4. 收集上清液（细胞质提取物）
5. 将沉淀重新悬浮在150 µL 1X高盐缓冲液中
6. 离心20分钟
7. 收集上清液（核提取物）

溶液配制

工作溶液配制

1.细胞液提取缓冲液（1X）：将100 µL的10X蛋白酶抑制剂（组分C）和1 µL的DTT（组分D）添加到0.9 mL的细胞质提取缓冲液（组分A）中。

2.核提取缓冲液（1X）：将100 µL 10X蛋白酶抑制剂（组分C）和1 µL DTT（组分D）添加到0.9 mL核提取缓冲液（组分B）中。

注意：0.5 mL 1X细胞质提取缓冲液和150 µL 1X核提取缓冲液足以进行1次测定，并根据需要准备新鲜的缓冲液。

实验步骤

1.用冷PBS冲洗细胞1次。 对于悬浮的细胞，请通过离心收集细胞。

2.向细胞中加入500 µL 1X Cytosol提取缓冲液。 对于贴壁细胞，将贴壁细胞刮入1.5 mL离心管中。

3.剧烈涡旋以完全重悬细胞。

4.以16,000 g离心1-2分钟，然后将上清液（细胞质提取物）转移到另一个干净的试管中。 将试管放在冰上以备下游使用或在-80°C下保存。

5.将沉淀重悬于150 µL 1X核提取缓冲液中。

6.剧烈涡旋以完全重悬沉淀。

7.将试管在4°C旋转30分钟。

8.以16,000g离心20分钟，然后将上清液（核提取物）转移到另一个干净的试管中。 将试管放在冰上以备下游使用或在-80°C下保存。

图示

图1.使用ReadiPrep 核/细胞质分离试剂盒（AATBioquest®，Cat＃60000）收集Hela细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 A.在有或没有HDAC抑制剂曲古抑菌素A的情况下孵育8ug核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。 B.使用40ug总蛋白的核或细胞质提取物。 2 ug / ml兔抗HDAC1抗体用于探测硝酸纤维素膜过夜。 使用了10 ug / ml的iFluor 647山羊抗兔IgG（H + L）（AATBioquest®，Cat#16809）。 该检测通过UVP多光谱成像系统（Biolite）可视化。 M：标记，Nu：核提取物，细胞：细胞质提取物。

图2.使用ReadiPrep Nucleus / Cytosol分离试剂盒收集了Jurkat细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有HDAC抑制剂Trichostain A的情况下孵育8 µg核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。

图3.使用ReadiPrep Nucleus / Cytosol Fractionation Kit收集了Hela细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有HDAC抑制剂Trichostain A的情况下孵育8 µg核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。

参考文献

Studied by Rapid Fractionation of Barley (Hordeum vulgare) Protoplasts
Authors: Gardestrom, P.; Wigge, B., Influence of Photorespiration on ATP/ADP Ratios in the Chloroplasts, Mitochondria, and Cytosol
Journal: Plant Physiol (1988): 69-76

and mitochondria
Authors: Lilley, R. M.; Stitt, M.; Mader, G.; Heldt, H. W., Rapid fractionation of wheat leaf protoplasts using membrane filtration : the determination of metabolite levels in the chloroplasts, cytosol
Journal: Plant Physiol (1982): 965-70

样品实验方案

简要概述

1. 用PBS洗涤细胞
2. 加入2 mL隔离缓冲液
3. 在冰上孵育10分钟
4. 使用均质器均质化细胞或添加试剂A。
5. 7000g离心10分钟
6. 去除上清液（细胞质部分）
7. 将沉淀重悬于隔离缓冲液中
8. 7000g离心10分钟
9. 将沉淀重悬于测定缓冲液（线粒体级分）中

实验步骤

1.用冷PBS洗涤细胞一次。 对于悬浮的细胞，请通过离心收集细胞。

2.向细胞中加入2 mL分离缓冲液（组分A），并在冰上孵育10分钟。

3.可以通过两种方式提取细胞质。

①：将40 µL试剂A（组分B）加入混合物中，涡旋并在冰上孵育10分钟。

②：使用Dounce组织研磨机匀浆4-5次，使细胞匀浆。

4.在4°C下以600 g离心10分钟，收集上清液，在4°C下以7,000 g离心10分钟。 上清是细胞质部分。

5.将沉淀重悬于1 mL分离缓冲液（组分A）中，并在4°C下以7,000 g离心10分钟。

6.丢弃上清液，并根据下游应用将沉淀重悬在适当的测定缓冲液中。

7.蛋白质浓度可以通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（Cat＃11100）进行定量。

图示

图1.使用ReadiPrep 线粒体/细胞质分离试剂盒收集HeLa细胞的线粒体组分。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有MitoLite Green（＃22675）的情况下孵育100 µg线粒体片段，并用NovoCyte 3000流式细胞仪进行测定。

参考文献

Studied by Rapid Fractionation of Barley (Hordeum vulgare) Protoplasts
Authors: Gardestrom, P.; Wigge, B., Influence of Photorespiration on ATP/ADP Ratios in the Chloroplasts, Mitochondria, and Cytosol
Journal: Plant Physiol (1988): 69-76

and mitochondria
Authors: Lilley, R. M.; Stitt, M.; Mader, G.; Heldt, H. W., Rapid fractionation of wheat leaf protoplasts using membrane filtration : the determination of metabolite levels in the chloroplasts, cytosol
Journal: Plant Physiol (1982): 965-70

样品实验方案

简要概述

1. 用PBS冲洗细胞
2. 加入500 µL细胞质提取缓冲液
3. 离心20秒
4. 收集上清液（细胞质提取物）
5. 将沉淀重新悬浮在150 µL 1X高盐缓冲液中
6. 离心20分钟
7. 收集上清液（核提取物）

溶液配制

工作溶液配制

1.细胞液提取缓冲液（1X）：将100 µL的10X蛋白酶抑制剂（组分C）和1 µL的DTT（组分D）添加到0.9 mL的细胞质提取缓冲液（组分A）中。

2.核提取缓冲液（1X）：将100 µL 10X蛋白酶抑制剂（组分C）和1 µL DTT（组分D）添加到0.9 mL核提取缓冲液（组分B）中。

注意：0.5 mL 1X细胞质提取缓冲液和150 µL 1X核提取缓冲液足以进行1次测定，并根据需要准备新鲜的缓冲液。

实验步骤

1.用冷PBS冲洗细胞1次。 对于悬浮的细胞，请通过离心收集细胞。

2.向细胞中加入500 µL 1X Cytosol提取缓冲液。 对于贴壁细胞，将贴壁细胞刮入1.5 mL离心管中。

3.剧烈涡旋以完全重悬细胞。

4.以16,000 g离心1-2分钟，然后将上清液（细胞质提取物）转移到另一个干净的试管中。 将试管放在冰上以备下游使用或在-80°C下保存。

5.将沉淀重悬于150 µL 1X核提取缓冲液中。

6.剧烈涡旋以完全重悬沉淀。

7.将试管在4°C旋转30分钟。

8.以16,000g离心20分钟，然后将上清液（核提取物）转移到另一个干净的试管中。 将试管放在冰上以备下游使用或在-80°C下保存。

图示

图1.使用ReadiPrep 核/细胞质分离试剂盒（AATBioquest®，Cat＃60000）收集Hela细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 A.在有或没有HDAC抑制剂曲古抑菌素A的情况下孵育8ug核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。 B.使用40ug总蛋白的核或细胞质提取物。 2 ug / ml兔抗HDAC1抗体用于探测硝酸纤维素膜过夜。 使用了10 ug / ml的iFluor 647山羊抗兔IgG（H + L）（AATBioquest®，Cat#16809）。 该检测通过UVP多光谱成像系统（Biolite）可视化。 M：标记，Nu：核提取物，细胞：细胞质提取物。

图2.使用ReadiPrep Nucleus / Cytosol分离试剂盒收集了Jurkat细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有HDAC抑制剂Trichostain A的情况下孵育8 µg核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。

图3.使用ReadiPrep Nucleus / Cytosol Fractionation Kit收集了Hela细胞的核和细胞质提取物。 通过Amplite 荧光荧光胺蛋白质定量试剂盒（AATBioquest®，Cat＃11100）对蛋白质进行定量。 在有或没有HDAC抑制剂Trichostain A的情况下孵育8 µg核或细胞质提取物，并通过Amplite 荧光HDAC活性测定试剂盒（AATBioquest®，Cat#13601）测量HDAC活性。

参考文献

Studied by Rapid Fractionation of Barley (Hordeum vulgare) Protoplasts
Authors: Gardestrom, P.; Wigge, B., Influence of Photorespiration on ATP/ADP Ratios in the Chloroplasts, Mitochondria, and Cytosol
Journal: Plant Physiol (1988): 69-76

and mitochondria
Authors: Lilley, R. M.; Stitt, M.; Mader, G.; Heldt, H. W., Rapid fractionation of wheat leaf protoplasts using membrane filtration : the determination of metabolite levels in the chloroplasts, cytosol
Journal: Plant Physiol (1982): 965-70