适用仪器

样品实验方案

简要概述

1. 在测定缓冲液中准备细胞
2. 添加Calbryte 520 AM染料加载溶液（1 µL）
3. 在37°C孵育30分钟
4. 清洗细胞
5. 添加钙通量激动剂
6. 在530/30 nm滤光片（FITC通道）使用流式细胞仪检测荧光强度

溶液配制

储备溶液配制

Calbryte 520 AM储备溶液（500X）：在Calbryte 520 AM储备溶液（组分A）的小瓶中加入100 µL DMSO（未提供），并充分混合。 注意：100 µL Calbryte 520 AM储备溶液足以进行100次测定。 如果试管密封严密，可以将未使用的Calbryte 520 AM原液分装并在<-20°C下保存超过一个月。 避光并避免重复的冻融循环。

实验步骤

1.除去细胞培养基，并加入0.5 mL测定缓冲液。注意：对于贴壁细胞和非贴壁细胞，建议分别使用4 x 10⁵ – 8 x 10⁵和1 x 10⁶-2 X 10⁶。每个细胞系应根据个体情况进行评估，以确定细胞内钙动员的最佳细胞密度。

2.将1µL Calbryte 520 AM储备溶液（500X）加到0.5 mL非标准或贴壁细胞的测定缓冲液（组分B）中。注意：如果细胞（例如CHO细胞）含有有机阴离子转运蛋白，则可将丙磺舒（组分C）添加到染料工作溶液中（最终孔浓度将为0.125-1 mM），以减少去离子水的泄漏。

3.将细胞在37°C下孵育30分钟。

4.对于非贴壁细胞，将细胞离心并去除染料。将细胞重悬于0.4 mL HHBS（组分D）中。对于贴壁细胞，使用0.5 mM EDTA轻轻地将细胞从板中提起并离心。将细胞重悬于0.4 mL HHBS（组分D）中。注意：要从板上分离贴壁细胞，可以考虑使用酶试剂（例如胰蛋白酶，Accutase），但需要进行测试以确保细胞表面上的目标受体不受影响。

5.用HHBS或所需的缓冲液制备5X激动剂化合物。

6.使用530/30 nm滤光片（FITC通道）在流式细胞仪上检测，在添加100 µL制备的激动剂之前和之后分析样品。注意：为获得最佳结果，重要的是在添加激动剂后1分钟内进行测定。确保激动剂添加到实际读数开始之间的时间对于所有样品保持恒定。

图示

图1.通过Cell Meter 流式细胞钙测定试剂盒在CHO-K1细胞中测量了ATP诱导的细胞内钙释放。将细胞与Calbryte 520 AM染料在37°C下孵育30分钟，然后向细胞中添加10μM的ATP， 在加入ATP后，获得基线并分析其余细胞。这种反应是随着时间的推移而测量的。分析在NovoCyte 3000流式细胞仪上进行。图表上的箭头表示添加ATP和实际分析之间的时间（30秒）。

通过Cell Meter 流式细胞钙测定试剂盒在CHO-K1细胞中测量了ATP诱导的细胞内钙释放。将细胞与Calbryte 520 AM染料在37°C下孵育30分钟，然后向细胞中添加10μM的ATP， 在加入ATP后，获得基线并分析其余细胞。这种反应是随着时间的推移而测量的。分析在NovoCyte 3000流式细胞仪上进行。图表上的箭头表示添加ATP和实际分析之间的时间（30秒）。B.荧光信号随时间的变化。

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适用仪器

样品实验方案

简要概述

1. 准备细胞密度为0.5-1×10 ⁶细胞/ mL
2. 用测试化合物处理细胞以诱导超氧化物
3. 将1 µL 500X MitoROS 580加到0.5 mL细胞悬液中
4. 将细胞在37°C染色1小时
5. 使用带有FL2通道的流式细胞仪检测荧光强度

溶液配制

储备溶液配制

1. MitoROS 580储备溶液（500X）：将100 µL DMSO（组分C）添加到MitoROS 580（组分A）小瓶中，并充分混合以制成500X MitoROS 580储备溶液。避光。注意：请密闭存放。

实验步骤

1. 对于每个样品，在自备的0.5 mL生长培养基或缓冲液中制备细胞，密度为5×10 ⁵至1×10 ⁶个细胞/ mL。注意：应单独评估每种细胞系，以确定超氧化物诱导的最佳细胞密度。
2. 在分析缓冲液（组分B）或自备的缓冲液（例如PBS）中用25 µL 20X测试化合物处理细胞以诱导超氧化物。对于对照细胞（未处理的细胞），添加相应量的化合物缓冲液。
3. 将细胞在37°C孵育至少30分钟。注意：将 Jurkat细胞在37°C下用50 µM抗霉素A（AMA）处理30分钟以诱导超氧化物。有关详细信息，请参见图1。
4. 将0.5 µL细胞悬浮液中加入1 µL 500X MitoROS 580储备液。
5. 在37°C下孵育1小时。注意：对于贴壁细胞，用0.5 mM EDTA轻轻提起细胞以保持细胞完整，并在MitoROS 580孵育之前用含血清的培养基洗涤一次。适当的孵育时间取决于单个细胞的类型和测试使用的化合物。
6. 使用带有FL2通道的流式细胞仪（Ex / Em = 488/590 nm）检测荧光强度。

 图示

图1.使用Cell Meter 荧光细胞内超氧化物检测试剂盒检测Jurkat细胞中的超氧化物。AMA处理（红色）：将细胞在37°C下用50 µM抗霉素A（AMA）处理30分钟，然后与MitoROS 580孵育1小时。对照（蓝色）：在未经AMA处理的情况下，将细胞与MitoROS 580在37°C孵育1小时。使用流式细胞仪（BD FACSCalibur）在FL2通道检测上荧光信号。

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