样品实验方案
简要概述
- 准备样品
- 将75 µL /孔的cAMP标准品或测试样品添加到抗cAMP的96孔板中
- 在室温下孵育5-10分钟
- 加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物
- 在室温下孵育3小时
- 用200 µL /孔的洗涤缓冲液洗涤4次
- 添加100 µL /孔的Amplite Green
- 在室温下孵育1至3个小时
- 检测405、650或740 nm处的吸光度增加
溶液配制
储备溶液配制
1. cAMP储备溶液（100 µM）：将1 mL测定缓冲液（组分B）添加到cAMP标准品（组分A）的小瓶中。
2. HRP-cAMP共轭原液（50X）：将55 µL（#36370）或550 µL（#36371）的测定缓冲液（组分B）添加到HRP-cAMP偶联物（组分C）的小瓶中。 注意：未使用的50X HRP-cAMP共轭原液应分为一次性使用的等分试样，并在-20℃下保存。
3.洗涤液（1倍）：将1 mL的10X洗涤溶液（组分D）添加到9 mL蒸馏水中。
标准溶液配制
在分析缓冲液（组分B）中对cAMP标准品进行1：10、1：100和1：3的系列稀释，以得到10,000、100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01和0.003 nM cAMP 稀释溶液。 存放在冰箱或4°C下。
工作溶液配制
HRP-cAMP偶联物工作溶液：
在使用前，用测定缓冲液（组分B）以1:50稀释，使其具有1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 存放在冰箱或4°C下。 注意：25 µL 1X HRP-cAMP偶联物工作溶液足以用于一个测定点； 准备适当的体积，仅供一次性使用，现配现用。
实验步骤
1.准备样品
1.1根据需要处理细胞：
以下是用Forskolin处理的Hela细胞以96孔板诱导cAMP的示例：吸出细胞生长培养基，在Hanks中加入100 µL /孔100μM Forskolin和20 mM Hepes缓冲液（HHBS），在5％CO2，37°C恒温箱，放置15分钟。孵育后吸出细胞溶液，加入100 µL /孔的细胞裂解缓冲液（组分E），然后在室温下另外孵育10分钟。该细胞裂解液可以直接测定，也可以在测定缓冲液（组分B）中稀释后测定。注意：应单独评估每个细胞系，以确定最佳细胞密度。细胞可以在实验的前一天或实验当天接种，具体取决于细胞类型和/或受试化合物的作用。
1.2组织样本：
由于组织中环状核苷酸的快速代谢，重要的是在收集后快速冷冻组织（例如，使用液氮）。称重冷冻的组织，并添加10-20 µL / mg细胞裂解缓冲液。在冰箱均质样品。高速旋转5分钟并收集上清液。上清液可以直接测定。
1.3尿液，血浆和培养基样品：
尿液和血浆可以直接在1X裂解缓冲液中以1：200至1：1000的稀释度进行测试。也可以在裂解缓冲液中以1:10至1：200的稀释度测试培养基。注意：RPMI介质可能包含> 350 fmol / µL cAMP。
2.cAMP测定
2.1所有测定孔均按以下顺序准备：A）cAMP标准品，对照或测试样品； B）HRP-cAMP偶联物。
2.2将75 µL /孔的cAMP稀释标准溶液和测试样品添加到抗cAMP Ab包被的96孔板（组分F）的每个孔中。 我们建议对每个标准品和测试样品重复测定。在室温下孵育5至10分钟。
2.3加入25 µL /孔的1X HRP-cAMP偶联物工作溶液。 将板放在摇床上，在室温下孵育3小时。
2.4吸出板内容物，并用200 µL /孔的1X洗涤液洗涤4次。
2.5在每个孔中加入100 µL /孔的Amplite Green（组分G），并在避光的情况下在室温下孵育60分钟至3小时。
2.6使用光吸收酶标仪检测在405 nm，650 nm或740 nm处的吸光度增加。
图示
图1.使用Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒在透明的96孔板中使用SpectraMax酶标仪测量cAMP剂量反应。 可以在405 nm（蓝线），650 nm（红线）或740 nm（绿线）处读取吸光度，图B中的数据来自与Amplite Green孵育3小时的结果。
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图2. cAMP剂量反应是通过Screen Quest 比色ELISA cAMP分析试剂盒在带有SpectraMax酶标仪的透明96孔板中测量的。 A：与Amplite Green孵育1小时（蓝线）和3小时（红线）后，该试剂盒在405nm的100 µL反应体积中可检测到低至0.1 nM cAMP。
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