试验方案

1. 准备细胞
2. 添加LysoBriteDeep Red染料工作溶液
3. 在37°C孵育30分钟至60分钟
4. 添加染色缓冲液
5. 室温孵育30分钟
6. 在荧光显微镜下Ex/Em =590/620nm（Texas Red滤光片组）处进行分析

注意：1）实验前，取出试剂盒进行室温冻结。

样品示例及使用方法

1.准备溶酶体染色溶液：

1.1  取出试剂盒中A、B、C组分，室温避光静置5-10min。

1.2  移取10μL LysoBrite Deep Red（组分A），用5mL细胞染色缓冲液（组分B）进行稀释，制备染料工作液。

注意：1) 10μL的500X LysoBrite Deep Red（组分A）足够完成一个96孔板，根据要求分装并储存未使用的500X LysoBrite Deep Red（组分A），避免反复冻融。

2)荧光溶酶体指示剂的最佳浓度根据实际应用而改变，可以根据探针的渗透性对细胞类型、细胞或组织的染色条件进行调整。

2.细胞染色：

• 对于贴壁细胞：

在96孔黑色墙壁/透明底板（50μL/孔/ 96孔板）或装有适当培养基内的培养皿的盖玻片上培养细胞，当细胞达到所需的汇合时，在96孔板或培养皿内加入1/2的LysoBrite Deep Red工作液，在37℃、5％CO₂条件下培养箱中孵育30分钟至60分钟，将(50 µL /孔/96孔板）的染色缓冲液B（组分C）加入LysoBrite Deep Red工作溶液板中，在室温下孵育15-30分钟。再使用配有Texas Red 滤片组的荧光显微镜观察细胞，使之带深红色荧光(Ex/Em = 590/620 nm)。

注意：1）LysoBrite Deep Red对细胞的毒性很小或没有，它可以用于细胞跟踪。为了进行细胞跟踪，可跳过添加染色缓冲液B的步骤，只需将染料工作液替换为生长培养基，然后在荧光显微镜下观察即可。如果细胞看起来没有充分染色，建议适当增加染料浓度或孵育时间。

• 对于悬浮细胞：

在1000rpm条件下离心培养液5分钟，得到细胞沉淀并弃去上清液，在预热（37℃）生长培养基例如（100 µL /管）中轻轻重悬细胞沉淀，然后添加1/2体积（50 µL /管）LysoBrite Deep Red工作溶液。在37℃、5％CO2条件下培养箱中孵育30分钟至60分钟，将(50 µL /孔/96孔板）的染色缓冲液B（组分C）加入LysoBrite Deep Red工作溶液板中,在室温下孵育15-30分钟。再使用配有Texas Red 滤片组的荧光显微镜观察细胞，使之带深红色荧光(Ex/Em = 590/620 nm)。

注意:  1）LysoBrite Deep Red对细胞的毒性很小或没有。它可以用于细胞跟踪。为了进行细胞跟踪，可跳过添加染色缓冲液B的步骤，只需将染料工作液替换为生长培养基，然后在荧光显微镜下观察即可。如果细胞看起来没有充分染色，建议适当增加染料浓度或孵育时间。 

        2）悬浮细胞可以附着在用BD Cell-Tak®（BD Biosciences）处理过的盖玻片上，并作为贴壁细胞染色。

示例数据分析及图示

图一：在Costar黑色透明底96孔板中用Cell Navigator 溶酶体染色试剂盒LysoBrite Deep Red染色Hela细胞的荧光成像结果。

图二：HeLa细胞分别用A和B，置于Costar黑壁/透明底96孔板中染色后的荧光成像结果，在0秒和120秒的曝光时间下，使用Olympus荧光显微镜对信号进行比较。 A: Cell Navigator溶酶体染色试剂盒(Cat# 22659)、B: LysoTracker®Red DND-99(来自Invitrogen公司)。

参考文献

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