样品实验方案
简要概述
- 准备细胞
- 除去生长培养基
- 加入I-Loading Buffer,用筛选化合物处理细胞
- 用DPBS缓冲液洗涤细胞3次
- 用1X裂解液裂解细胞
- 添加等体积的I-sensor(50或25 µL)
- 将0.1X加到I- Sensor Enhancer(50或25 µL)
- 在室温下孵育10秒至10分钟
- 检测380 nm,405 nm或630 nm处的吸光度
溶液配制
储备溶液配制
细胞裂解缓冲液(1X):将整个小瓶的10X细胞裂解缓冲液(组分D)添加到45 mL无菌H2O中,并充分混合。 注意:5 mL 1X细胞裂解缓冲液足以装满一块板。 将未使用的1X细胞裂解缓冲液储存在4℃。
工作溶液配制
I- Sensor Enhancer工作溶液(1X):将50 µL 100X碘化物增强指示剂(组分B)加入5 mL无菌H2O中并充分混合。 注意:1X I- Sensor Enhancer工作溶液不稳定,请稀释后2小时内使用。 注意:应单独评估每个细胞系,以确定I-Sensor Enhancer溶液的最佳稀释度。 我们观察到0.1X I-Sensor Enhancer工作溶液在某些细胞系中效果更好。
实验步骤
1.碘化物流出测定
1.1从细胞板上吸出生长培养基。
1.2加入100 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)的预热I-上样缓冲液(组分C)并孵育2-4小时。
1.3完全吸出碘化物上样缓冲液。 用DPBS或HBSS清洗细胞至少3次。
1.4在HBSS缓冲液中用激动剂处理细胞5分钟。 注意:为筛选拮抗剂,将化合物与I上样缓冲液孵育至少30分钟,然后再用DPBS或HBSS缓冲液洗涤细胞。
1.5吸出上清液。
1.6通过添加50 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)的1X细胞裂解缓冲液来裂解细胞。
1.7进行碘化物测定。
2.用于碘化物流入分析
2.1从细胞板上吸出生长培养基。
2.2加入预热的I-上样缓冲液(组分C)和测试化合物100 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)并孵育5分钟。
2.3完全吸出碘化物上样缓冲液。 用HBSS洗涤细胞3次。
2.4通过添加50 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)的1X细胞裂解缓冲液来裂解细胞。
2.5进行碘化物测定。
3.运行碘化物测定
3.1从碘化物流入/流出测定选择的孔中添加50 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)的Iodide Blue 指示剂(组分A)。
3.2向混合物中加入50 µL /孔(96孔板)或25 µL /孔(384孔板)的1X碘化物指示剂增强剂溶液。 注意:对于某些细胞系,您可能需要将增强剂溶液稀释至0.1X。
3.3在室温下孵育10秒-10分钟。 注意:应单独评估每个细胞系,以确定最佳孵育时间。 注意:由于存在高浓度的碘化物,蓝色可能在数秒至数分钟内变为黄色。
3.4检测630、380或405 nm处的吸光度。
图示
图1. NaI剂量反应是在透明的96孔板上用Screen Quest 比色氯通道测定试剂盒测量的。
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参考文献
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